前言

       補(bǔ)料工藝的優(yōu)化是發(fā)酵工藝優(yōu)化最重要的研究方向之一，持續(xù)而又穩(wěn)定的補(bǔ)料速率往往對(duì)最終產(chǎn)物的合成和菌株的代謝方向影響較大。多數(shù)產(chǎn)物的合成在補(bǔ)料過(guò)程中需要嚴(yán)格將培養(yǎng)基中的糖控制在一定濃度。傳統(tǒng)的控糖主要依靠操作人員不斷地取樣檢測(cè)與手動(dòng)調(diào)節(jié)補(bǔ)料速度，時(shí)效性較差，調(diào)控效果也較差。發(fā)酵工程師們也始終在尋找著更穩(wěn)定，更精確的控糖方式。本案例以色氨酸生產(chǎn)菌株E. coli TM01為出發(fā)菌株，采用賽多利斯（7 L）平行生物反應(yīng)器，分別通過(guò)手動(dòng)控糖和生物培養(yǎng)過(guò)程在線檢測(cè)儀（BODS）的自動(dòng)檢測(cè)控糖策略?xún)煞N不同方式維持培養(yǎng)基中葡萄糖濃度，以色氨酸產(chǎn)量為指標(biāo)來(lái)對(duì)比不同控糖模式的差異。

圖1 天木生物生物培養(yǎng)過(guò)程在線檢測(cè)儀（BODS）

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

       實(shí)驗(yàn)菌種：E. coli WT01。

       種子液培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，葡萄糖20 g/L；

發(fā)酵液培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，酵母提取物7 g/L，一水合檸檬酸1.1 g/L，硫酸銨7.5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，三水合磷酸氫二鉀3 g/L，七水合硫酸鎂1 g/L，七水合硫酸鐵0.1 g/L，維生素B1 0.1g/L，甘油10 g/L，抗壞血酸 0.45 g/L，搖瓶發(fā)酵額外加入碳酸鈣5 g/L；

       發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：取甘油管中菌種活化后轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)12 h后，按5%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵過(guò)程在賽多利斯7L發(fā)酵罐中進(jìn)行，通氣量為1vvm，通過(guò)溶氧關(guān)聯(lián)攪拌轉(zhuǎn)速將溶氧控制在30%，通過(guò)流加氨水將pH維持在6.9。37℃培養(yǎng)至OD600到10左右后，降溫至30℃并加入IPTG誘導(dǎo)。發(fā)酵過(guò)程中當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗完畢后，流加500 g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)菨舛瓤刂圃?/span> 2 g/L。

       手動(dòng)補(bǔ)料組每1 h取樣檢測(cè)培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛?，并根?jù)所測(cè)濃度手動(dòng)調(diào)整補(bǔ)料策略。自動(dòng)補(bǔ)料組使用天木生物的生物培養(yǎng)過(guò)程在線檢測(cè)儀（BODS）實(shí)時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛?，并由儀器自動(dòng)調(diào)整補(bǔ)糖策略。發(fā)酵液中色氨酸濃度由液相進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

       如圖2所示，在手動(dòng)補(bǔ)料模式下，由于無(wú)法實(shí)時(shí)觀察菌體的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛炔▌?dòng)較大，而且由于夜間操作人員疲勞，誤差最大時(shí)甚至達(dá)到了+10 g/L的差異。殘?zhí)菨舛鹊牟▌?dòng)直接影響了菌體的生物量和色氨酸產(chǎn)量，手動(dòng)控糖組色氨酸產(chǎn)量最高時(shí)僅有約0.3 g/L。而與之相比，BODS的智能關(guān)聯(lián)補(bǔ)料完全摒棄了人為操作帶來(lái)的誤差，可以全天候?qū)崟r(shí)監(jiān)控發(fā)酵液中菌體的生長(zhǎng)情況、檢測(cè)培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛龋ò咐性O(shè)置為1 h自動(dòng)取樣并檢測(cè)一次）并反饋給系統(tǒng)，然后根據(jù)設(shè)置值實(shí)時(shí)調(diào)整補(bǔ)料策略使糖穩(wěn)定的維持在設(shè)定值（2±0.2g/L），更好的控糖策略也帶來(lái)了色氨酸產(chǎn)量的大幅度增加，與手動(dòng)補(bǔ)料模式相比，BODS智能關(guān)聯(lián)補(bǔ)料模式下色氨酸產(chǎn)量提高了約71.4%。

圖2 手動(dòng)補(bǔ)料和智能關(guān)聯(lián)補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果對(duì)比

結(jié)論

       本案例以產(chǎn)色氨酸工程菌株為出發(fā)菌株，研究了不同補(bǔ)料策略下對(duì)菌株色氨酸產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：更穩(wěn)定的控糖方式往往會(huì)帶來(lái)產(chǎn)量大幅度的增加。與手動(dòng)補(bǔ)料模式相對(duì)比，BODS智能關(guān)聯(lián)系統(tǒng)在無(wú)操作人員的情況下通過(guò)自動(dòng)取樣檢測(cè)、監(jiān)控、反饋調(diào)節(jié)、自主學(xué)習(xí)補(bǔ)料策略等方式將培養(yǎng)基中殘?zhí)撬?/span>穩(wěn)定的控制在了設(shè)定值（2±0.2g/L），也使菌株的色氨酸產(chǎn)量提高約71.4%，這說(shuō)明了BODS在發(fā)酵工藝優(yōu)化中的重要作用。除此之外，在工業(yè)化生產(chǎn)中殘?zhí)菨舛鹊目刂埔彩侵苯佑绊懫髽I(yè)產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵參數(shù)，BODS的實(shí)時(shí)檢測(cè)能力也有助于生產(chǎn)車(chē)間人員實(shí)時(shí)掌控發(fā)酵過(guò)程變化，及時(shí)調(diào)整工藝參數(shù)，幫助企業(yè)更好的完成產(chǎn)物的放大生產(chǎn)。

       自成立伊始，天木生物恪守客戶至上的原則，致力于提供高度專(zhuān)業(yè)化的菌種優(yōu)化方案，為發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化提供更多可靠選擇。