1月27日，清華大學(xué)化工系生物育種技術(shù)與裝備團隊在《核酸研究》（Nucleic?Acids Research）發(fā)表文章，采用高通量手段系統(tǒng)研究了sgRNA與靶標DNA錯配效應(yīng)對dCas9結(jié)合活性的影響。

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近年來，作為可編程的DNA靶向工具，CRISPR/(d)Cas系統(tǒng)在基因編輯、高通量遺傳篩選、染色體成像、合成基因路線構(gòu)建、新型抗菌藥物和體外核酸檢測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。對于每個應(yīng)用而言，向?qū)NA（sgRNA）與靶標DNA之間的序列同源性對CRISPR/(d)Cas系統(tǒng)活性的影響都是至關(guān)重要的。為加深對這個問題的理解，作者在大腸桿菌中構(gòu)建了兩個覆蓋所有單核苷酸和雙核苷酸突變的sgRNA文庫，并利用高通量的方法在活細胞內(nèi)解析了文庫中每個sgRNA介導(dǎo)dCas9與靶標DNA結(jié)合的親和力。

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圖1?高通量解析不同錯配sgRNA對dCas9與靶標結(jié)合活性的影響

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該研究基于高通量實驗手段發(fā)現(xiàn)種子區(qū)域（PAM近鄰7-12 bp）的錯配對結(jié)合活性的影響較大，而PAM遠端區(qū)域可以容忍多個錯配；種子區(qū)的錯配存在協(xié)同效應(yīng)，即兩個錯配的組合對結(jié)合活性的影響大于兩個對應(yīng)單獨錯配影響的加和。特別的，相對于其它錯配類型，dDrG（D = A, T, G）對dCas9結(jié)合的影響相對溫和，與核酸熱力學(xué)數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出一致性，并得到了進一步的實驗驗證。

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圖2?錯配sgRNA介導(dǎo)的CRISPR/dCas9結(jié)合活性的系統(tǒng)解析

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CRISPR/(d)Cas9識別并結(jié)合靶標主要分為兩個步驟，首先是PAM （NGG）的識別及其近鄰堿基的熔化，接著是鏈侵入過程，即sgRNA與熔化的靶標DNA發(fā)生退火，并延伸至PAM遠端?；贑RISPR/(d)Cas9的結(jié)合機理和實驗觀測，論文將鏈侵入過程的狀態(tài)轉(zhuǎn)移視作馬爾可夫鏈，并使用文獻報道的核酸熱力學(xué)數(shù)據(jù)計算每個狀態(tài)的概率，最終發(fā)現(xiàn)dCas9的解離概率與結(jié)合親和力存在較強的負相關(guān)關(guān)系，并能很好的與文獻報道的體外實驗數(shù)據(jù)吻合。該模型也能外推至更多錯配的情形，一定程度上證明了其普適性，對于深入理解和應(yīng)用CRISPR系統(tǒng)的脫靶結(jié)合效應(yīng)具有重要意義。

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圖3?CRISPR/dCas9的結(jié)合親和力受核酸熱力學(xué)控制

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化工系張翀副教授和王天民博士（現(xiàn)為清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士后）為本文通訊作者，生物育種技術(shù)與裝備團隊首席邢新會教授為本文共同作者。馮匯寶博士研究生、郭佳薈博士、王天民博士為本文的共同第一作者。該成果得到了國家自然科學(xué)基金委重點儀器研發(fā)項目、面上項目和博士后基金的資助。

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論文鏈接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkaa1295/6121456